论著
HBx缺失突变体介导RhoGDIα表达下调对肝癌细胞迁移和侵袭的影响
肿瘤研究与临床, 2017,29(9) : 577-583. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2017.09.001
摘要
目的

探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)缺失突变体(HBxΔ31)抑制Rho蛋白二磷酸鸟苷解离抑制因子α(RhoGDIα)表达的作用机制及其对肝细胞癌(HCC)转移的影响。

方法

选取稳定表达野生型HBx及其缺失突变体HBxΔ31蛋白的HCC细胞株HepG2为研究对象,采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及蛋白印迹法检测HBxΔ31对RhoGDIα表达的影响。构建RhoGDIα启动子区系列缺失报告基因载体,与真核表达载体HA-HBx及HA-HBxΔ31共转染HepG2细胞,荧光素酶活性检测确定HBxΔ31关键作用区域。免疫共沉淀(Co-IP)鉴定HBxΔ31与转录因子myc相关锌指蛋白(MAZ)间的相互作用,凝胶电泳迁移率实验(EMSA)分析HBxΔ31对MAZ与RhoGDIα启动子结合的影响。体外迁移和侵袭实验观察RhoGDIα对HBxΔ31介导HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响。

结果

HBxΔ31在转录水平抑制了RhoGDIα基因的表达,其作用核心区位于其启动子的-460~-242 bp区域,对该区域3个转录因子MAZ结合位点突变分析,证实MAZ参与HBxΔ31对RhoGDIα的表达调控。Co-IP提示HBxΔ31能与MAZ相互作用,EMSA分析显示MAZ通过与RhoGDIα启动子结合发挥作用,而HBxΔ31增强了这种效应。体外侵袭和迁移实验表明,对照组与RhoGDIα干扰组的HepG2细胞迁移数分别为(58±5)个和(98±7)个,侵袭细胞数分别为(55±6)个和(113±6)个,差异均有统计学意义(t=18.91和t=20.12,均P<0.01);而转染HBxΔ31的HepG2细胞迁移数[(115±6)个]和侵袭细胞数[(102±5)个]均多于共转染RhoGDIα与HBxΔ31的HepG2细胞迁移数[(40±4)个]和侵袭细胞数[(42±4)个](t=18.14和t=16.31,均P<0.001)。

结论

HBxΔ31通过与MAZ相互作用增强其与RhoGDIα启动子的结合,导致RhoGDIα表达下调,从而促进肝癌细胞的侵袭和迁移。

引用本文: 李卫华, 李辉, 顾霞, 等.  HBx缺失突变体介导RhoGDIα表达下调对肝癌细胞迁移和侵袭的影响 [J]. 肿瘤研究与临床,2017,29( 9 ): 577-583. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2017.09.001
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乙型肝炎病毒(HBV)慢性持续性感染是导致肝细胞癌(HCC)最主要的原因。HBV X蛋白(HBx)是病毒基因组编码的唯一多功能调节蛋白,在HCC发生、发展中起关键作用。HBx作为反式激活因子,通过激活细胞质中的多条信号转导通路,或与细胞核中转录因子直接结合,调控宿主细胞基因表达,从而参与细胞增殖、凋亡、分化以及迁移等生物学过程[1,2]。近年发现,HCC组织中广泛存在高频自发的HBx基因缺失突变,产生羧基端截短的HBx蛋白,与HCC的发生、发展密切相关[3,4],但机制尚未明确。我们前期研究发现,HCC组织中HBx基因nt368-376/nt372-380缺失突变的发生率较高,因而形成羧基端截短31个氨基酸的突变体(HBxΔ31);体外功能分析表明,HBxΔ31较野生型HBx蛋白具有更强的促HCC细胞迁移和侵袭的能力,该作用可能与其下调了Rho蛋白二磷酸鸟苷解离抑制因子α(RhoGDIα)表达有关[5]。新近发现,RhoGDIα在HBV相关HCC组织中表达下调,且与患者不良预后相关[6,7]。那么,HBxΔ31是否通过调控RhoGDIα表达,参与HCC转移发生?本研究通过检测HBxΔ31对HCC细胞RhoGDIα表达的影响,继而探讨其调控机制,观察HBxΔ31介导的RhoGDIα异常表达对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响,为揭示HBxΔ31参与HCC进展的机制,探寻HCC治疗靶点提供依据。

 
 
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