论著
分化抑制因子基因沉默的人尤文肉瘤细胞系的建立
肿瘤研究与临床, 2015,27(5) : 305-309. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2015.05.004
摘要
目的

应用短发夹RNA(shRNA)技术,构建分化抑制因子(Id2)基因稳定干扰的人尤文肉瘤细胞系,为进一步研究Id2在尤文肉瘤细胞生长、分化中的作用提供有用模型。

方法

体外合成3条Id2序列特异性shRNA,构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Id2真核表达载体,通过脂质体转染尤文肉瘤RD-ES细胞,采用Western blot方法检测Id2蛋白表达水平,采用细胞计数法检测shRNA转染后对细胞生长的影响,采用流式细胞术检测转染前后细胞周期的变化。

结果

Western blot结果显示,稳定转染shRNA-Id2-543及shRNA-Id2-593的RD-ES细胞中Id2表达水平降低,与对照组相比分别下降54%及57%;转染组细胞的生长速度明显减慢,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期S期细胞比例分别为(36.60±1.53)%及(44.89±2.46)%,高于对照组的(29.73±2.03)%,差异有统计学意义(P<0.05),G2期比例无明显变化甚至降低。

结论

成功建立Id2基因沉默的人尤文肉瘤RD-ES稳定转染细胞系。Id2表达下调可抑制尤文肉瘤细胞增殖,细胞周期阻滞于S期。Id2可能在尤文肉瘤细胞生长增殖中扮演重要角色。

引用本文: 李鑫, 张娜娜, 岳冠军, 等.  分化抑制因子基因沉默的人尤文肉瘤细胞系的建立 [J]. 肿瘤研究与临床,2015,27( 5 ): 305-309. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1006-9801.2015.05.004
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分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id)又称DNA结合抑制因子(inhibitor of DNA binding),属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)转录因子家族成员之一,对碱性HLH(bHLH)转录因子起负性调节作用[1]。目前在哺乳动物中发现了4种Id蛋白,即Id1、Id2、Id3和Id4,分别定位于人染色体20q11、2p25、1p36.1和6p21-22[2]。Id家族成员均有高度保守的HLH结构域,一般在未分化细胞中表达,而在终末细胞中表达水平较低[3]。研究表明,Id基因表达与肿瘤细胞增殖、分化、侵袭及不良预后等密切相关[4,5]。尤文肉瘤(Ewing sarcoma)是儿童和青少年好发于骨和软组织中的小圆细胞肿瘤,恶性程度高,病程短、进展快,早期即发生转移,其病因及发病机制研究是目前亟待解决的问题之一。大多数尤文肉瘤都有特异性染色体易位,其中85%以上为t(11; 22)(q24;q12),形成EWS-Fli1融合基因[5]。Fli1基因属于DNA结合转录因子ETS家族成员,与细胞永生化及肿瘤形成有关[6]。研究表明,EWS-ETS可通过一系列下游分子包括Id2参与肿瘤细胞发展及演进[7]。Id2在尤文肉瘤中呈弥漫高表达,但其作用机制尚不清楚,我们采用RNA干扰技术抑制尤文肉瘤细胞系中Id2基因的表达,探讨Id2在尤文肉瘤细胞增殖中的作用,并为进一步研究其功能打下基础。

 
 
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稳定转染
Id2基因
shRNA
尤文肉瘤细胞